在蛋白质缓冲液中加入DTT。电泳缓冲液是Tris-甘氨酸电泳缓冲液。SDS缓冲液是上样缓冲液，必须添加Tris。-Hcl，DTT，SDS，溴酚蓝和甘油。
PH8.8Tris分离胶配置过程中的缓冲液-Hcl。
PH6.8Tris是浓缩胶配置过程中的缓冲液。-Hcl。电泳式缓冲液是加电泳槽的，tris、甘氨酸缓冲液。
试样缓冲液就是loadingbuffer，解决蛋白质样品，分离胶缓冲液就是tris-hclph8.8。
2.DTT对蛋白质的作用蛋白质溶解液中常见的试剂包括尿素、硫脲、CHAPS、DTT、在IPGbuffer等方面，尿素和硫脲是离液剂(变性剂)，高浓度尿素和硫脲可破坏蛋白质分子之间形成的氢键，避免在蛋白质转移过程中由氢键引起的蛋白质聚集和二级结构的建立。
CHAPS是一种两性表面活性剂(去垢剂)，它能融化疏水基团，提高蛋白质的溶解度。
3.DTT无效对蛋白质的危害1、连接缓冲液的影响：大致缓冲液含有以下成分：20-100mmol/LTris-HCl，常用的50mmol//L，PH范围为7.4-7.8，比较常用的是7.8，目的是给一个适合酸碱度的连接系统；MgCl2，10mmol/L，作用是激活酶反应；1-20mmol/LDTT，常用的10mmol//L，其作用是保持氧化环境，稳定酶活性，25-50ug/mlBSA，其作用是增加蛋白质浓度，避免因蛋白质浓度过稀而导致酶失活。不同于限制酶缓冲液，连接酶缓冲液还含有0.5-4mmol/L。ATP，常用1mmol//L，这是酶反应所必需的。不同于限制酶缓冲液，连接酶缓冲液还含有0.5-4mmol/L。ATP，常用1mmol//L，这是酶反应所必需的。2、pH值的影响：一般将缓冲液的pH值调整到7.4-7.8，比较常用。实验表明，如果将pH为7.5-8.0后的酶活性列为100%，那么当系统偏碱(pH为8.3)时，仅为所有活力的65%。；如果系统偏酸(PH为6.9)，则只有40%的活力。3、ATP浓度危害：ATP浓度在0.5-4mmol/L之间，连接缓冲液中的ATP浓度较为常用。L。结果表明，ATP的适宜浓度为0.5-1mmol/L，过于强烈会抑制反应。例如，5mmol/L的ATP将完全阻止平尾端连接，10%的粘端连接也将被阻止；另外，当ATP浓度为0.1时，mmol在/L时，去磷酸载体的自环比较大。由于ATP很容易溶解，所以当连接反应失败时，除了DNA和酶的难题之外，还应该注意ATP的因素。应在-20℃储存带有ATP的缓冲液，融化取出后立即放入。当连接缓冲液体积较大时，最好分管存放，以免反复冻融造成ATP溶解。与限制酶缓冲液不同，长时间放置后含有ATP的缓冲液通常是无效的，因此可以自主配置没有ATP的缓冲液(可以长期保存)，临时添加新配制的ATP母液。4、连接温度和持续时间的影响:由于粘性末端的DNA双链之间有氢键的作用，温度过高会使氢键不稳定，但连接酶的最佳温度只有37℃。为了解决这种差异，在充分考虑之后，传统上将连接温度列为16℃，时间为4-16h。经过实验发现，20℃30min对于一般粘性终端来说足以达到很好的连接效果，但如果时间充裕，20℃60min可以使连接反应更加彻底。对于平尾端，不必考虑氢键问题，可以使用较高的温度，使酶活力得到更好的发挥。5、酶浓度危害：每天使用的DNA浓度比酶企业定义的低10-20倍，连接平尾端时酶的消耗量比连接粘端大10-100倍。粘合端连接时，应优先稀释。稀释液的成分与酶储存的缓冲液相同或相似。稀释液中的酶可以长时间保持活力，随时方便取用。6、DNA浓度危害：要求获得环化高效连接物，DNA浓度不能过高，一般不能超过20nmol/L。对连接物质进行线性连接，DNA的浓度可以更高，至少接近推荐的浓度。当大载体进行大片段复制时，以及双酶片段的连接反应，DNA浓度也应该降低，甚至DNA的总浓度也应该降低到几个nmol/L。根据另一项研究，DNA末端T4DNA连接酶的表面Km值为1.5。nmol/L，所以，DNA浓度在连接时不应低于1nmol//L。也就是说，应该有2nmol/L的末端浓度。
DTT蛋白酶抑制剂蛋白质组学中蛋白质样品酶解法-胶内酶解法
蛋白质试品进行凝胶电泳后，用刀片将目标粘胶切掉，放入EP管中。
2.用超纯水清洗胶块，然后震荡1分钟，放置5-10分钟清洗胶中的残留物。然后倒出液体，用超纯水反复清洗，吸水纸吸出液体。
3.⑴银色染色褪色：30mmol/LK3Fe(CN)6:100mmol/LNa2S2O3=1:使用前的新鲜配置。(参考2mL的配置：K3Fe(CN)6：在1ml超纯水中溶解9.9mg，在1mL超纯水中溶解15.85mg，：1搅拌)常见问题：每次加10个样品，加满褪色液内置白纸观察，色调脱去后立即放水100ul清洗终止反应，2分钟内吸出，加100ul水反复清洗2次，直至褪色液颜色完全清洗(胶水变得透明)，褪色后加入50%乙腈，放置15分钟后，吸出液体。
⑵考试染色褪色：加50％乙腈，37℃水浴褪色，约30分钟。可以看到胶上染料基本去除，变得透明。如果胶上颜色残留较深，可以将液体吸出，重复一遍，直到染料脱落，胶块变得透明。
4.100%乙腈脱干至胶块变白，放置，若胶块未变白，可将乙腈吸出，再倒入100%乙腈脱干一次。
添加氧化剂：NH4HCO325mm(含10mMDTT)，密封，水浴57℃1h。参考配置：6.2mgDTT，NH4HCO3溶于4mL25mM。(如果是2-DE胶，立即跳到第8步)
6.从水浴取下试品后，室温冷却，去除液体，快速加入同体积烷基化试剂，在室温暗处放置30分钟。.
烷基化学试剂：NH4HCO325mm(含55mMIAA)
参考配置方法(4mL)：在4mL25mm的NH4HCO3中，40.69mgIAA溶于4mL25mm
去除烷基化试剂，加入50。％放置15min的乙腈
增加50mm的NH4HCO3波动后，静放吸胀5min，然后吸出。
9.先放50％再次脱干乙腈，再换100。％从乙腈脱干到胶块变白。
每管加入适量酶液(约2-3)μL），在胶块吸收酶液之前，将冰面放置30分钟。
酶液配置：2μ添加15000预冷遮盖液的GTrypsinμL
遮盖液(2mL)配置：100％乙腈200μL，NH4HCO30.50mmmL，超纯水1.3mL
常见问题：从冰箱中取出酶后的所有操作过程，包括在试品中加入酶后，将酶放入冰中。
检查酶液吸胀情况，抽出多余的酶液，酶液不足，即胶块中仍有白色，则加入适量的酶液。
加盖液20uL密封，37℃保温16-18小时。
13.提纯
(1)从37度水浴锅中取出样品后，超声5min，10000g/1min.
(2)将上清转移到新的200μ在L的EP管中。
(3)在剩余橡胶块中加入提取物(100%乙腈) SDS胶带使用2.5%TFA，2.5%TFA，67�用于MALDI，5%FormicAcid67�N用于ESI；90%乙腈 2.5%TFA用于2D胶)，37%保温30min，超声波，合拼。
3mL提取物参照配置3mL：75μLTFA、2010μL100％乙腈、915μL超纯水。
(4)超声15min，间距5min，反复超声15min。温度不超过40度。
(5)10000g/1min，合拼上清。
冷藏离心干躁14
银染疑胶 考马斯亮蓝色上色疑胶
5.DTT蛋白蛋白酶，说白了，溶解蛋白质的酶是一种切割活力广泛的丝氨酸蛋白酶。用于生物样品中蛋白质的一般溶解，切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键。在RNA获取中，蛋白酶k的作用通常是溶解RNA酶，以避免RNA的溶解。
6.酶切中dtt的作用常见的蛋白质裂解液成分尿素：常见浓度8M硫脲：常见浓度2MDTTT：作为氧化剂，在肽链之间打开二硫键除污剂：SDS,NP-40,TritonX-CHAPS抑制蛋白酶活性的方法100，细胞裂解后释放蛋白酶，必须抑制其活力，方法如下：
增加强变性剂
低温
调整pH，pH>很多蛋白酶在9点失活，但是要注意目地蛋白是否也失活。
添加PMSF等蛋白酶抑制剂
蛋白质谱检测步骤蛋白获取——>浓度测量——>蛋白质分类(SDSPAGE等)——>除盐，聚集——>恢复，烷基化——>酶切——>除盐/标识——>分级分离肽段——>质谱检测
dtt在蛋白裂化中的作用这种蛋白质是用来沉积植物组织的，你要沉积细菌的蛋白质，把磨叶换成病菌细胞破壁就可以了：
三氯乙酸-甲苯沉淀法
1、用液氮粉碎叶子
2、在-20℃的条件下，加入体积3倍的提取物，然后离心(4℃8000rpm以上1小时)抛弃上清。
3、添加冰浴甲苯等体积(含0.07%)β-混合后离心(4℃8000rpm以上1小时)，然后真空干燥沉积，预留。
4、取样前加入裂解液，室温放置30分钟，使蛋白质充分溶解在裂解液中，然后离心(15℃8000rpm以上1小时或更长时间以无沉积为基准)，可临时储存在4℃备用。
5、使用Brandford法定量蛋白质，然后可以分装到-80℃预留。
药物：
提取物：TCA含量10%，0.07%β-甲苯是一种甲基乙醇
裂解液：(最终体积为5ml)，使用时倒入1MDTT65ul//ml。
这种方法对双向电泳具有残渣少、离子浓度低的特点！自然单边电泳也同样适用，只有电泳的杂带会减少！
8.DTT在获得蛋白质方面的作用关键词:大脑目地:熟练地获取大脑蛋白的背景知识:没有原理:没有主要内容:大脑总蛋白提取方法1．样品秤的低温保存。2．加入裂解液。样品版本和组织比例=1：3~3.5w/v，通常是150~170mg：500μl。添加50×蛋白酶抑制剂Cocktail。可以利用振荡器，加样器，将组织块飘散。3．液氮中冻融3~4次。1min/time，当然，在室温下溶解。4．超声破碎。将含有裂解液的EPtube埋入冰中，超声3~4sec//time，强度为强度较大的3/4。间距超过10sec。直到溶液透明。小心使用空泡效果。5．添加DnaseI，RnaseA。10μg/μl，5μl。4℃30min。6．离心25~30mins4℃14000g/min。7．推上清，分装。储存。Tris(40毫米)细胞裂解液.8mg尿素(urea)(7M).408g硫脲（thiourea）(2M).044g4%.二硫苏糖醇8g1%(DTT)..44mg(EDTA)(1mm)加双蒸水到5ml10ml20ml
9.DTT是保护蛋白质还是破坏蛋白质？DTT是一种硫醇氧化剂，当浓度达到50毫米时，可以恢复大多数蛋白质的半胱氨酸残基。一般来说，1-2毫米可以保护蛋白质。－SH效果，超过10毫米就可以破坏已形成的二硫键。
